本发明公开了一种连续逆流微通道萃取制备高纯度胆固醇的方法，属于化学工程技术领域。其包括以下步骤：（1）将正庚烷、乙酸乙酯、甲醇和水按0.9‑1.2:1.1‑1.3:0.8‑1.0:1体积比混合，静置后分出上、下相，用上相溶液溶解胆固醇粗品，下相溶液用乙酸调节PH=3.7‑4.5作为萃取剂；（2）萃取剂对胆固醇粗品溶液进行连续逆流微通道萃取；（3）将经过逆流微通道萃取得到的胆固醇溶液蒸发，用乙醇重结晶胆固醇。本发明采用连续逆流微通道萃取技术分离提纯胆固醇粗品得到高纯度医药用胆固醇，是一种高效快速制备高纯度医药用胆固醇的方法。